一种纵条纹炭角菌菌株及其菌核培育方法与流程/

本发明属于食药用真菌领域,具体涉及一种纵纹夏科氏菌菌株及其菌核栽培方法。

背景技术:

Xylariastriata 属于木聚糖科,是木聚糖属的一种真菌 [1]-[3]。 西南科技大学黄毅、雷传文、袁晓红等于2015年申请专利《纵纹菌的应用》表明,纵纹菌子实体或醇提取物具有显着的药用价值。具有镇静催眠作用,可用于治疗失眠、焦虑或惊厥等神经系统疾病,效果良好。 西南科技大学袁世军、何新生、袁晓红等人于2019年申请了“一种利用液体培养基生产炭菌子实体的方法”专利,发明了直接使用液体的方法产生木炭真菌子实体的培养基。 ,该方法工艺简单,易于实施,产菌效率高。

Charcoria属真菌种类较多,但对该属真菌的研究起步较晚,迄今已报道61种。 大部分夏科氏菌属真菌都具有良好的医疗保健作用。 特别是菌核是中药的组成部分。 主要化学成分为多糖、核苷、环肽、羧酸等活性物质以及萜类化合物。 次生代谢产物,如类固醇、甾醇、生物碱和聚酮化合物。 其中,C. nigricans是目前研究最多、最著名的C. nigricans真菌,具有药用和食用价值。 目前已上市的药品有“龙神”胶囊、“五灵神”胶囊等。 黑曲霉的菌核称为五灵参,是一种极其昂贵的中药材[4]。

发明内容

本发明提供了一种纹状棒孢菌菌株及其菌核培养方法。 该菌株的菌核可作为中药“五灵神”。

本发明的菌株xylariastriata是野生分离的,采集于云南省昆明市西山区碧鸡镇小七十郎社区的林下。 对其进行形态分析、分子鉴定和菌核培养。 该菌株被命名为xylariastriata yk-4,属于木聚糖科木聚糖属。 菌类。 2020年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc),保藏号:cgmccno.19660。

本发明提供了一种木虱,其主要形态特征和生物学特性为:

该菌株在 25°C 的富集 PDA 培养基上避光培养。 菌丝白色,气生菌丝较多;

幼时的底座呈黄白色。 随着它们的生长,颜色加深,变黄后变成黑色。 基座顶部黄白色,杆状,密集丛生,有1-2级分枝,第1级分枝。 呈分叉,二级枝由1个顶端同时分枝出2-11个小分枝,形成总状分枝(见图1);

胸骨有明显的灰白色纵纹,尖端呈锥形,尖端无菌;

菌核呈条状或滴状,表面黑色,内果肉白色、坚实。

本发明所述的纵纹苋菜菌株是从林下的纵纹苋菜子实体中采集的,是组织分离得到的纯培养菌丝体。

根据本发明,C.纵纹可以在多种母培养基上生长,其中富集pda培养基(马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂20g/l、磷酸二氢钾3g/l、蛋白胨3g/l,pH 6.5)是最好的培养基。

根据本发明,本发明的纵纹菌采自森林下的纵纹菌子实体,是经组织分离得到的纯培养菌丝体。

本发明提供了一种C.纵向条纹菌株,其含有其序列seqidno:3,或具有超过97.0% (例如,97.0%、97.1%、97.2%、97.3%、97.4%、97.5%、97.6)序列号:3%、97.7%、97.8%、97.9%、98.0%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、 99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%)同一性。

本发明提供了一种纵条纹真菌。 以菌核干重计,菌核中甘露醇含量为9.0%-11.7%,是野生鸡枞的2倍,显着高于野生松茸和黑牛肝菌。 ETC。; 同样以菌核干重计,菌核中腺苷含量为0.028%-0.034%,高于野生冬虫夏草幼虫期0.023%的腺苷含量。

本发明还提供了一种木霉yk-4的菌核栽培配方(wt%):78%锯末、10%土壤、5%大米、5%麦麸、1%糖、1%石膏1%以及利用该配方栽培菌核的方法。该配方的生物效率为12.15%,为迄今为止报道的最高水平。

发明效果

本发明的纵纹吊兰的菌核富含药典中衡量吊兰药用价值的重要成分(甘露醇和腺苷),其含量高于目前报道的许多食药用真菌。

附图及简要说明

为了更加清楚地描述本发明的技术方案,下面结合附图进行简要介绍。 显然,这些附图只是本申请描述的一些具体实施方式。 本发明包括但不限于以下附图:

图1为人工培养的垂直条纹分枝菌孢子。

例子

为了进一步理解本发明,下面结合本发明的具体实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。 显然,所描述的实施例是本发明的一部分,但不是全部。 基于本发明实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有修改,都属于本发明要求的保护范围。

实施例1

菌株的分离和保存

在超净工作台上,将采集的野生C. longistriata菌株通过组织分离的方法接种到富集的pda培养基中,25℃恒温避光培养6 d。 每天观察记录,消除污染细菌。 培养皿,选择生长良好的培养皿作为母种。 剪下长宽各0.8cm的菌丝体方块,置于装有无菌蒸馏水的离心管中,4℃保存。

菌株yk-4的分子鉴定

将yk-4菌丝体加入离心管中,加入适量液氮研磨菌丝体; 提取方法参照真菌DNA提取试剂盒(新型快速植物基因组DNA提取试剂盒,biotakecorporation)的步骤; PCR扩增:以yk-4基因组DNA为模板,正向引物its4(5′-tcctccgcttattgatatgc-3′, seqidno:1)和反向引物its5(5′-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3′, seqidno: 2)被使用; 引物由生工生物工程(上海)有限公司提供。

PCR反应系统

反应程序

95℃变性5分钟,进入循环。 循环条件为94℃变性30秒,56℃退火45秒,72℃延伸1分钟,35个循环后72℃延伸10分钟。 反应结束后,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

琼脂糖凝胶电泳法

①称取1g琼脂糖粉,加入制胶用锥形瓶中,加入100ml 1×tae电泳缓冲液,微波炉加热融化;

②冷却至65℃左右时,加入核酸染料,混匀,倒入预先插好梳子的凝胶板中;

③待胶水冷却凝固后,拔出梳子;

④电泳槽中加入1×tae buffer,点样样品,电压电流220v/180a电泳约30分钟;

⑤使用凝胶成像系统观察PCR产物。

yk-4菌株的序列测序

目的条带清晰的PCR产物经凝胶切割、纯化后送上海生工科技有限公司测序。 利用DNAman软件、mega6.0软件和NCBI数据库在线软件()对yk-4株的序列进行比较。 分析。

测序

将得到的测序结果进行人工校正,得到591bp的序列:

(序列号:3)

对比分析

将yk-4菌株的序列在NCBI数据库中进行比对,发现yk-4菌株的序列与登录号为gu300089.1的xylariastriata的总体得分、覆盖度和相似度最高,分别为989、99%、96.95%,该菌株被鉴定为xylariastriata。

实施例2

菌核培养配方的筛选

配方1:78%锯末、20%土壤、1%糖、1%石膏

配方2:78%锯末、10%土壤、5%大米、5%麦麸、1%糖、1%石膏

配方3:98%水稻培养基、1%石膏、1%糖

配方4:78%玉米芯、20%土壤、1%糖、1%石膏。

4个配方的培养物分别分装瓶中。 每瓶高度为6cm,每瓶平均湿重为100g。 121℃高压灭菌2小时,冷却后接种,保持接种量一致。 培养条件置于培养箱中:温度25℃,避光培养,培养物含水量65%,室内培养湿度60%。 结果表明,配方2的生物效率最高,生长成熟时间最短(见下表1)。

表格1:

注:生物效率为培养物干重与所产金耳鲜重的比值。

菌株活性物质的测定

甘露醇的测定

参照2015年版药典《五灵胶囊》中甘露醇的测定方法[5],称取样品0.4g,加水20ml,称重,水浴加热回流2小时,取出冷却,补足减掉的重量,摇匀并过滤。 取续滤液作为供试品储备液,量取供试品储备液2ml,置于碘瓶中,准确加入高碘酸钠(钾)溶液50ml,水浴加热15℃。分钟,取出冷却。 加碘化钾试液10ml,密封,放置5分钟,用硫代硫酸钠滴定剂(0.02mol/l)滴定,接近终点时,加淀粉指示液1ml,继续滴定至蓝色消失,用滴定结果空白试验进行校准。

结果表明,xylariastriata yk-4菌株菌核甘露醇含量达到11.7%,是野生鸡杉的2倍,显着高于野生松茸、黑牛肝菌等真菌[6]。

腺苷的测定

参照2015年版药典五灵胶囊中腺苷的测定方法[5],采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂; 以甲醇-0.04mol/l磷酸二氢钾溶液(10:90)为流动相; 检测波长为260nm,根据腺苷峰理论板数应不少于2000。 对照品溶液的制备,取腺苷对照品溶液适量,精密称定,加水制成每1ml含腺苷20μg的溶液。 测定方法:精密吸取甘露醇物质下对照品溶液和供试品储备液各10μl,注入液相色谱仪,测定。

结果表明,xylariastriata yk-4菌株菌核中腺苷含量为0.034%,高于野生冬虫夏草幼虫期腺苷含量0.023%[7]。

参考

[1] 郭琳. 中国真菌(第59卷):吊兰[m]. 北京:科学出版社,1992.4-8。

[2] 毛晓兰主编. 2000.中国大型真菌[m]. 郑州:河南科学出版社,2000:570-575。

[3]linnaeusc.florasvecicaexhibensplantasperregnumsueciaecrescentes,1745,2.salvii,斯德哥尔摩。

[4]温少峰,曹耀,杨林雷,周忠发,李荣春。 药用吊兰的研究进展[J]. 食药用真菌, 2019, 27(02): 106-111.

[5]中国药典.2015年1部.

[6] 胡淑琴,陈志毅,邹玉晓,时颖,刘学明。 比色法测定15种食用菌中甘露醇的含量[J]. 现代食品科学与技术, 2010, 26(08): 901-903+912.

[7]卢伟杰,唐永凡,高瑞东。 高效液相色谱法测定冬虫夏草和常见食用菌中腺苷和虫草素的含量[J]. 现代医学与临床,2011,26(04):313-315。

序列表

云南菌视生物科技有限公司

一种纵纹炭角菌及其菌核培养方法

spi203422-43

专利倒转3.3

20

脱氧核糖核酸

正向引物

tcctccgcttattgatatgc20

22

脱氧核糖核酸

反向引物

ggaagtaaaagtcgtaacaagg22

第591章

脱氧核糖核酸

人工序列

tccgtaggtgaacctgcggagggatcattaaagagttcataactcccaaacccatgtg60

aacctacctttgttgcctcggcaggtctgcagcttaccctgtgagaccctaccctgtagg120

gaccttaacctggtagttgcgggtaaagcctgccggtggtctactaaactctgtttaactat180

gttatctgaataatataactaaataagttaaaactttcaacaacggatctcttggttct240

ggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaa300

tcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccattagtattctagtgggcatgcctgttcga360

gcgtcatttcaacccttaagcccttgttgcttagcgttgggagcttacagaaaccctctg420

标签ttccttaaagttagtggcagagttggtttcacactctagacgtagtaaattttatct480

cgcctatagatgaaccggccccttgccgtaaaaccccttaatttttaaaggttgacctcg540

gatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaaaagccggaaggaa591

技术特点:

1、 一种xylariastriata菌株,其主要形态特征和生物学特性包括:

该菌株在 25°C 的富集 PDA 培养基上避光培养。 菌丝白色,气生菌丝较多;

幼时的底座呈黄白色。 随着它们的生长,颜色加深,变黄后变成黑色。 基座顶部黄白色,杆状,密集丛生,有1-2级分枝,第1级分枝。 二级分枝呈叉状,从一个顶端同时分枝出2-11个小分枝,形成总状分枝;

胸骨有明显的灰白色纵纹,尖端呈锥形,尖端无菌;

菌核呈条状或滴状,表面黑色,内果肉白色,坚实。

2.根据权利要求1所述的纵纹苋菜菌株,其是从林下纵纹苋菜的子实体中分离得到的纯培养菌丝体。

3.根据权利要求1或2所述的C. longistriata菌株,其中所述富集pda培养基包括马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂20g/l、磷酸二氢钾3g/l、蛋白胨3g/l。 l、ph为6.5。

4.一种长纹C. longistriata菌株,其菌核中甘露醇含量为9.0%-11.7%,腺苷含量为菌核干重的0.028-0.034%。

5.一种C.纵向条纹菌株,其包含其序列seqidno:3,或具有超过97.0% (优选97.5%、98.0%、98.5%、99.0%、99.5%、或什至99.9%)与seqidno:3同一性。

6. C.纵条纹菌株yk-4,保藏号为cgmccno.19660。

7.根据前述权利要求中任一项所述的纵条纹菌株的菌核培养方法,其特征在于,包括按照以下菌核培养配方进行培养的步骤:杂木屑78%、土壤10%、稻米5%、小麦5% %麸皮,1%糖,1%石膏。

8.根据权利要求7所述的菌核培养方法,其特征在于,生物效率高达12.15%。

技术概要

本发明属于食药用真菌领域,具体涉及一种纵纹夏科氏菌菌株及其菌核培养方法。 本发明的纵纹吊兰的菌核富含药典中衡量吊兰药用价值的重要成分(甘露醇和腺苷),其含量高于目前报道的许多食药用真菌。

技术研发人员:李荣春; 文少峰; 李梦洁

受保护技术使用者:云南菌视生物科技有限公司

技术研发日:2020.09.11

技术公告日期:2020.12.04

作者 admin